PTR-TOF动态分析鼻腔中白酒风味变化
TOFWERK
2023/10/04 18:12
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白酒被称为中国的国酒，一般由高粱和其他谷物经过固态发酵、蒸馏和陈化生产而来。白酒的香味多样，包括浓香、酱香、谷香、花香等，这些香型被总结为白酒风味轮（图1）。其中，浓香型（strong aroma-type）最受欢迎，具有独特的窖香和强烈的果香和菠萝香，窖香有类似烧烤和发酵过程的泥土气味，被视为高质量浓香型白酒的特点。据文献报道，白酒中有超过2000种风味物质，是蒸馏酒中香味物质最丰富的。此前的原位风味分析主要通过分析唾液成分来实现，而唾液成分并不能完全代表口腔环境。直接进样PTR-TOF质谱仪可以通过呼气模块直接取样口腔或鼻腔中气体，实时分析和监测口腔环境，更真实反映白酒在食用过程中影响观感的组分动态变化。实时进样也最大程度避免了传统采样和存储过程中可能出现的活性物种损失或者副反应。同时，相对于传统GC方法，PTR-TOF对含氧，含氮及含硫等风味物种有更好更广更敏感的覆盖能力。
鼻后嗅觉香气实验借鉴了前人实验，采用TOFWERK Vocus PTR-TOF检测呼吸气中的白酒味道和回味。8位品评员饮用4mL白酒后，戴上专用面罩来采集鼻腔中的呼吸气（120秒），空白呼吸气为饮酒前30秒，每个样品重复测量三次，每次测量期间，品评员至少休息1小时，并摄入足量饮用水。
Vocus PTR-TOF总采样气流为2L/min，呼吸气样品气流约10mL/min，整个实验期间飞行时间质谱仪的分辨率约10,000。
实验过程中，Vocus PTR-TOF共监测到超过500个离子（m/z 20-300），扣除空白呼吸气背景后，研究员用相对标准偏差（RSD）和Mann-Kendall趋势性检验评估了所有离子，保留RSD＞50的离子从而确保白酒香气分子在整个实验中有足够的信号强度变化，并确保离子的M-K检验z＜0且p＜0.01，即离子在余味中呈显著性递减趋势。总共有69个离子被用作表征白酒香气的目标离子。基于GCxGC-MS的结果，82种香味物质对应的24个PTR-TOF离子峰为白酒主要的挥发性物质。
一般将饮酒过程分为“风味爆发阶段（burst-stage）”和“余味阶段（after-taste）”，两个阶段之间有离子峰的转折点。本研究使用了分层聚类分析（HCA）来评估白酒香气的主要挥发性香味物质，这些物质被分为7组，图2显示了它们的强度变化。
组A：主要由小分子醇、醛、酚、呋喃和含硫化合物组成，它们极性强，log P值小（即亲水性强），能够在口腔内快速释放。它们的甜味和酒味在白酒的“风味爆发阶段”占主导，由于气味迅速消逝，几乎不参与白酒的余味。而在白酒陈化过程中，小分子间的共价键不断形成，组A物质会越来越少，白酒的“爆发”强度也会越来越低。
组B：组B又进一步分为组B-1和B-2。组B-1中主要是C3-6的醇、酸、酯、含硫化合物和乙酸乙酯。其中，乙酸乙酯是白酒的主要风味物质；3-甲硫基丙醇嗅觉阈值很低，是芝麻香型白酒的重要风味。该组化合物在“爆发阶段”信号迅速升高，并在余味阶段迅速降低，它们主要贡献了白酒入口阶段的花香味和甜味。组B-2中主要是C6-8的醇、酯、酸和酮。该组的化合物释放晚于B-1组，但对余味的贡献很大。这主要是因为碳链长度主导了化合物的极性和log P值，从而导致了B-1组和B-2组不同的风味释放特性。
组C：组C包括乳酸乙酯和硫代丁酸甲酯。在饮酒时，乳酸乙酯迅速在鼻腔中挥发，由于白酒中乳酸乙酯含量很高，它在余味阶段仍有很高强度，口腔黏膜对酯类也有一定滞留效果，延长了香气的释放。
组D：组D为苯乙醛、对甲苯醛、3,3-二乙氧基-1-丙醇。其中，苯乙醛有甜味和可可香气，香气活性值（OAV）=4，即对白酒香气有较大贡献。在爆发阶段，这些物质呈波动性变化，而在余味阶段，它们和组B-2消逝速度类似。
组E：组E主要是C8-10的酯、醇和酸。关键香气物质是己酸乙酯和庚酸乙酯，它们具有强烈的甜味、果香味和菠萝香味。在作者此前研究中，具有脂肪和蜡质香气的辛酸和1-壬醛也具有很高的OAV。这些物质在爆发阶段信号上升，并在余味阶段缓慢下降。由于它们的log P值较大，所以很难释放到口腔气中，而是保留在口腔黏膜表面的蛋白上。
组F：这组主要是苯乙酸乙酯和2-乙酸苯乙酯，它们的log P值很高，因此很难释放到口腔中，主要在白酒余味中。苯乙酸乙酯（OAV=6）具有蜂蜜和玫瑰香气，是白酒余味的重要组分。
组G：组G主要是C10的酯，由于它们疏水性较强，很少参与香气组成。
白酒品酒过程中的挥发性香气物质释放与具体的物质种类、极性，尤其是，疏水性相关。白酒物质释放到鼻腔的过程是挥发性物质在乙醇-水溶液和周围空气中挥发的动态平衡。比如，白酒中酯的释放就与碳链长度有关，碳链越短，酯的亲水性越强，在爆发阶段信号上升和余味阶段信号下降得越快，而碳链越长，酯就越倾向于留在口腔中，形成余味。其他课题组有类似的发现。化合物浓度同样重要，高浓度的乳酸乙酯在整个品酒过程中都是香气的主要贡献者。
课题组使用偏最小二乘回归（PLSR）研究香气物质与白酒的9种感官评价的关系。如图3中显示，数值越高表示香气物质对该感官评价的贡献度越大，负值表示该组物质能够屏蔽相应感官。分析结果显示，对酯类物质，E组（C8-10化合物）对白酒关键风味贡献最大，提供了果香、甜味和花香，B-2组（C6-8化合物）次之，B-1组（C3-6化合物）较少，G组的长链酯（C10）对感官评价贡献最小。
乳酸乙酯是最重要的白酒香气物质，与曲香（Qu-aroma）和蒸馏谷物香气（Distilled grain aroma）关联性较强。D组的苯乙醛、对甲苯醛有草项、肉桂和椰子香，连同3,3-二乙氧基-1-丙醇，它们丰富了白酒的动态感官轮廓。A组小分子具有甜味、奶油味、酒香和焦糖香，与白酒的甜味有强烈关联。F组的苯乙酸乙酯与谷物香（Grain aroma）和甜味强烈关联。
值得注意的是，白酒的动态风味轮廓与课题组之前研究的静态风味轮廓有明显区别，动态风味轮廓中引起感官评价变化的主要香气物质是1-丁醇、乳酸乙酯、苯乙醛、辛酸、己酸乙酯和庚酸乙酯。PTR-TOF对含氧风味物种的高灵敏度检测能力以及完整动态捕捉能力更有效地帮助区分白酒的“风味爆发阶段”和“余味阶段”的风味轮廓，以及不同物质对两个阶段的动态风味贡献。
[1] doi.org/10.1016/j.lwt.2023.114430
PTR-TOF靠谱系列之“品茶”
TOFWERK
2023/10/04 18:15
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茶在我国历史悠久，是茶文化的发源地，有人认为可追溯到上古时期，有“茶之为饮，发乎神农氏”之说。因茶具有特殊的风味和健康效果，茶在全世界范围内也非常流行。日常生活中，人们品茶，更是“品”其香味，可谓“未尝甘露味，先闻圣妙香”。茶水散发的香气对品茶人有着强烈的冲击，从而直接影响人们的感官。我国的茶叶类型非常多，这些不同类型的茶叶的香型也非常多，据不完全统计，有毫香型、嫩香型、花香型、果香型、清香型、火香型、甜香型、陈醇香型、松烟香型等。这些香味据报道有多达700包含了多种挥发性化合物[1]，包括醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、含硫化合物等等，如绿茶中具有清香味道的二甲硫（C2H6S）、成品茶中具强烈而稳定的令人愉快香气的苯乙酮（C8H8O）、成品茶叶挥发的具果实、干果类香气茶螺烯酮（C13H20O2）等。对这些香味物质的检测手段，主要是利用一维或多维气象分离与质谱相结合的方式来进行（CG-MS或GC×GC-MS）分析离线采集样品，测试中通常需要根据目标风味物质物化性质考虑分离柱的极性和搭配，同时样品分离时间一般在数十分钟以上。
直接进样、快速检测、高质量分辨率的快速质谱检测方式目前报道的相对较少。在此，我们利用Vocus CI-TOF质谱仪对不同类型的茶叶进行了测试（见图1），分别测量了不同茶叶刚泡发时所挥发出来的香味，本次Vocus CI-TOF使用的是质子转移反应电离模式（PTR H3O+模式），茶叶开水泡发之后移至仪器进样口进行直接分析，最大程度减少样品采集中损失以及最大程度模拟人体感官。仪器测量数据采样频率设置为1s/全谱，每组样品的测量时间约为1~2分钟，待样品信号稳定后结束测量并利用除烃空气冲洗进样口，排除样品间残留干扰。本次测试共检测到了百多个变化较明显的信号，我们在此挑选了一些比较有趣的检测结果做进一步解读。
图1. Vocus PTR-ToF质谱仪直接进样检测泡发茶水顶空气体
图2对比了笔者家乡所产的绿茶（a）和某红茶（b）所测到的相对信号。总的来看，绿茶的释放的香气相对简单，Vocus CI-TOF检测到数十个变化比较明显的信号，除了m/Q 63 (C2H6SH+,二甲硫）的信号较强，其他信号的强度较小，说明绿茶的清香味道主要还是来自于二甲硫，受到其它因子的影响较小；某红茶释放的香味则复杂的多，Vocus PTR-TOF检测到了数百个变化比较明显的信号，且大部分的信号强度都较高。
在本次检测中，我们在某红茶的检测到了一些茶叶中比较明显存在的香味因子。图3是样品中检测到的分子质量比较大的两个物质，这两个因子出现在m/Q 153的位置，两个物质的精确质量分别为m/Q 153.0546和m/Q 153.1274,值得注意的是，区分开这两个因子需要分辨率不低于3000 Th/TH的质谱仪来进行检测，两个因子分别对应的分子式为C8H9O3+和C10H17O+。C8H9O3+对应的可能物质为香草醛；C10H17O+对应的可能物质为薄荷酮或茴香酮。
图3. Vocus PTR-TOF在m/Q 153处检测到的物质谱图
此外，还检测到了乙酸（C2H6O2）、苯乙酮（C8H8O）、丁香酚（C10H12O2）、 茶螺烯酮（C13H20O2）等茶叶中常见物质。
Vocus PTR-TOF直接进样，广谱物质检测的能力，秒级响应的高时间分辨率、以及pptv-级别超低检测限、为茶样风味物质的快速全面检测分析和样品筛查提供了新的检测思路。
[1] Zhai, X., Zhang, L., Granvogl, M., Ho, C.-T. and Wan, X.: Flavor of tea (Camellia sinensis): A review on odorants and analytical techniques, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 21, 5, 3867-3909, https://doi.org/10.1111/1541-4337.12999, 2022.
如何靠‘谱’品酒： Vocus PTR-TOF高通量白酒样品风味分析
TOFWERK
2023/10/04 18:16
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白酒的历史悠久，根据原料和工艺的不同，白酒香型较为多样 [1]。自古以来，人们就钟情于高品质的酒，描述“好”酒的佳句颇多，如诗仙李白的“兰陵美酒郁金香，玉碗盛来琥珀光”， 王翰的“葡萄美酒夜光杯， 欲饮琵琶马上催”，王维的“新丰美酒斗十千，咸阳游侠多少年”等。酒香不怕巷子深，通常香味是人们判断酒品质的第一印象，而且品质较好的白酒一般具有较为特殊且复杂的风味。闻香识酒是品酒师们的基本技能，但由于从业门槛高，培训时间长，感官评价偏主观，及可能受身体状况影响也使得酿酒行业在寻找可补充或替代的分析解决方案。单纯从化学的角度讲，酒的香味主要来自于酒体中所含的挥发性物质，尤其是含氧物种，也有某些含氮和有机硫物种等。近期有学者提议利用科学的人工干预白酒发酵过程来直接调控白酒风味。
相对于传统的色谱或者色谱质谱方案，近年来兴起的快速质谱技术，尤其是质子转移反应（PTR-TOF）质谱法因其高通量分析能力，全谱风味物种检测能力以及较好的灵敏度，逐渐成为含酒精类饮品风味分析平台核心仪器之一。除了直接分析酒类风味之外，直接进样PTR-TOF质谱仪也可通过呼气模块直接取样口腔或鼻腔中气体，实时分析和监测口腔环境，更真实反映白酒在食用过程中影响观感的组分动态变化（引用‘PTR-TOF动态分析鼻腔气中白酒的风味变化’公共号文章）。
本次测试中，我们共测量了20个不同类型的酒样，包含不同香型的白酒和白兰地。测试中为降低酒精对信号的影响，对酒样进行了稀释。通过比较稀释后的酒样的完整质谱图，选择了最佳的稀释浓度进行样品测量，来最大程度上减少乙醇所带来的基体影响，保证风味物质的最大检测效果。本次测量Vocus CI-TOF的采样时间设置为1s/全谱（包含m/Q <400的所有谱峰），每个样品的持续进样测量时间约30秒，切换样品期间利用干净空气吹扫样品残留以恢复仪器本底信号：完成20个样品的检测时间小于20分钟。如利用自动顶空进样系统进行采样，进样测量则更加简单，单个样品检测分析时间也将更快（可达到<5秒/样品）。
基于本次检测结果，我们选取了谱图上60多个变化趋势较明显的峰浓度进行了比较分析。图1中X轴是不同物质对应的质荷比，Y轴是样品编号，图中圆圈越大、颜色越深，则表示对应的风味物质浓度越高。从该图可见，不同酒样所测到的这60多种代表性挥发性物质的浓度差别较为显著，部分分子量较小（m/Q<100）的挥发性物质比较常见，但浓度有所差异。少部分挥发性物质（m/Q>200）仅在部分样品中测到，具有一定的独特性。如样品20种测到了分子量在m/Q 300左右且浓度较高的物质，可能是特征性风味分子。
Sample 1-20中测量到的不同物种的浓度比较，圆圈的大小表示浓度的高低
图2展示了sample 20的质谱图，浓度较高的几个的信号，这些含氧有机分子一般都是传统分析方法鉴别检测不充分或者不了的物种。我们在此对这些信号进行了初步的分析（相对误差均＜5ppm）：
· m/Q 145.1223，该信号对应的分子为C8H17O2+，可能是乙酸己酯hexyl acetate或辛酸乙酯ethyl octanoate [2];
· m/Q 89.0597, 其分子组成为C4H9O2+，该信号可能是乙酸乙酯Ethyl acetate或丁酸Butyric Acid；
· m/Q 117.0910, 其分子组成为C6H13O2+，该信号可能来自于异丁酸乙酯Ethyl isobutyrate或乙酸丁酯Butyl acetate或乙酸异丁酯Isobutyl acetate或丁酸乙酯Ethyl butyrate；
· m/Q 145.1587,其分子组成为 C9H21O+, 该信号可能是1-壬醛1-Nonanol或2-壬醛2-Nonanol或2,6-Dimethyl-4-heptanol；
· m/Q 75.0804, 其分子组成为C4H11O+，该信号可能是正丁醇1-Butanol或异丁醇Isobutanol。
值得注意的是，样品20中检测到了几个之前文献没有报道过的特殊的峰，比如m/Q 289.2373, 其分子式为C16H33O4+，该物质可能是一种二甘醇月桂酸酯Diethylene glycol monolaurate；m/Q 261.206036, 其分子式为C14H29O4+，该物质初步定性为2-(2-Methoxyethoxy)ethyl nonanoate。
基于Vocus CI-TOF的全谱记录能力，本次检测数据中还有很多有趣的信号值得深入去发掘和探究。同时，Vocus CI-TOF质谱仪快速分析样品的能力，能够满足对大批量的样品进行实时在线的快速检测，尽可能的缩短对样品的检测时间，有助于提升对大批量产品的品控和筛查能力。
[1] 白酒基础知识扫盲：12种香型风味各不同，喝过5种就算是老酒客
[2] Chen, L., Yan, R., Zhao, Y., Sun, J., Zhang, Y., Li, H., Zhao, D., Wang, B., Ye, X. and Sun, B.: Characterization of the aroma release from retronasal cavity and flavor perception during baijiu consumption by Vocus-PTR-MS, GC×GC-MS, and TCATA analysis, LWT, 174, 114430, https://doi.org/10.1016/j.lwt.2023.114430, 2023.